PEMBUATAN TANAMAN TRANSGENIK TAHAN HAMA

Keuntungan Tanaman Transgenik

Tanaman tahan hama adalah tanaman transgenik yang telah disisipi gen organisme yang dapat menghasilkan toksik yang dapat menjadi insektisida. Selama ini dalam pengendalian hama digunakan insektisida kimiawi, namun penggunaannya memiliki kekurangan yakni juga membunuh serangga bukan target seperti lebah. 

Penggunaan tanaman transgenik memiliki keunggulan.

1. Dapat memperluas pengadaan sumber gen resisten karena sumber gen tidak hanya dapat diperoleh dari tanaman dalam satu spesies tetapi juga dari tanaman lain spesies, genus atau famili, bahkan dari bakteri, fungi, dan mikroorganisme lainnya; 
2. Dapat memindahkan gen spesifik ke bagian yang spesifik pula pada tanaman; 
3. Dapat menelusuri stabilitas gen yang dipindahkan atau yang diintroduksikan ke tanaman dalam setiap generasi tanaman; 
4. Memungkinkan mengintroduksi beberapa gen tertentu dalam satu event transformasi sehingga dapat memperpendek waktu perakitan tanaman dengan resistensi ganda (multiple resistance); 
5. Dapat menelusuri dan mempelajari perilaku gen yang diintroduksi dalam lingkungan tertentu, seperti  kemampuan gen suatu tanaman untuk pindah ke tanaman lain spesies (outcrossing), dan dampak negatif dari gen tersebut dalam tanaman tertentu terhadap lingkungan dan organisme bukan sasaran.

Gen Tanaman Transgenik Indonesia

Berikut ini beberapa gen yang telah dikembangkan di Indonesia

Tanaman	Karakter	Gen	Institusi
Jagung	Tahan penggerek batang	Pin II	BB Biogen
Kacang Tanah	Tahan peanut stripe virus	CP	BB Biogen, IPB
Kakao	Tahan penggerek buah	Bt	Balit Perkebunan
Kedelai	Tahan penggerek polong	Pin II	BB Biogen
Padi	Tahan wereng cokelat	Bt. GNA	BB Biogen, P3B LIPI
Pepaya	Tahan papaya ring spot virus	CP	BB Biogen, Balitsa, Balitbu
Tebu	Tahan penggerek batang	Bt	P3GI
Tembakau	Tahan tobacco mosaic virus	CP	Balittas
Ubi Jalar	Tahan hama boleng	Pin II	BB Biogen

Keterangan : BB Biogen = Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetika Pertanian, Balitsa = Balai Penelitian Tanaman Sayuran, Balitbu = Balai Penelitian Tanaman Buah, Balittas = Balai Penelitian Tanaman Tembakau dan Serat, P3B LIPI = Pusat Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi LIPI, P3GI Pusat Penelitian dan Pengembangan Gula Indonesia, Balit Perkebunan = Balai Penelitian Perkebunan

Pembuatan Tanaman Transgenik pada Padi yang Tahan Terhadap Serangan Hama.

Isolasi

Untuk membuat tanaman transgenik padi yang tahan terhadap hama, pertama-tama dilakukan identifikasi atau pencarian gen cry 1Ab yang akan menghasilkan kristal protein yang bersifat toksik terhadap Lepidoptera. Gen ini berasal dari bakteri Bacillus thuringiensis. Untuk menyisipkan gen cry 1Ab pada sel tanaman padi, maka terlebih dahulu harus dilakukan isolasi DNA yang mencakup gen tersebut. Caranya yaitu dengan pemecahan sel menggunakan enzim lisozim yang dapat memecah dinding sel dengan dikombinasikan dengan pemanasan terlebih dahulu sehingga sel lebih mudah untuk pecah. Setelah itu dilakukan pemurnian DNA genom dan kemudian dilakukan pemotongan DNA.

Pemotongan DNA

Pemotongan DNA genom B. Thuringiensis dengan menggunakan enzim endonuklease restriksi, yang sering digunakan adalah tipe II (enzim EcoRi) karena urutan nukleotida yang dikenali dan dipotong oleh enzim tersebut adalah sama sehingga memudahkan kloningnya.

Penyambungan DNA ke Dalam Vektor Plasmid Ti.

Molekul-molekul DNA yang mempunyai ujung hasil pemotongan yang sama dapat disambung dengan menggunakan enzim DNA ligase. Potongan DNA genom B. Thuringiensis kemudian disambungkan dengan potongan Plasmid Ti dalam sel Agrobacterium tumefaciens yang dapat digunakan untuk menyisipkan gen cry 1Ab ke dalam genom tanaman karena ada fragmen T-DNA yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman pada waktu Agrobacterium tumefaciens menginfeksi sel tanaman. Gen cry 1Ab yang disisipkan pada daerah retriksi selanjutnya dapat diperbanyak di dalam sel Escheria coli sebagai inang sementara. Vektor rekombinan yang membawa gen cry 1Ab kemudian dimasukkan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciens yang membawa plasmid Ti alami. Kemudian kedua plasmid tersebut berekombinasi homolog dan menyebabkan plasmid alami terintegrasi. 

Gambar 1. skema kloning gen cry1Ab

Transformasi

a) Metode senjata gen atau penembakan mikro-proyektil. 

Metode ini sering digunakan pada spesies jagung dan padi. Untuk melakukannya, digunakan senjata yang dapat menembakkan mikro-proyektil berkecepatan tinggi ke dalam sel tanaman. Mikro-proyektil tersebut akan mengantarkan gen cry 1Ab untuk masuk ke dalam sel tanaman padi. Penggunaan senjata gen memberikan hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan sel selama penembakan berlangsung. 

b) Metode transformasi yang diperantarai oleh Agrobacterium tumefaciens. 

Metode Agrobacterium melibatkan penggunaan bakteri tanah dikenal sebagai Agrobacterium tumefaciens yang memiliki kemampuan untuk menginfeksi sel-sel tumbuhan dengan sepotong DNA-nya Bakteri Agrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman secara alami karena memiliki plasmid Ti, suatu vektor (pembawa DNA) untuk menyisipkan gen asing. Di dalam plasmid Ti terdapat gen cry 1Ab yang ingin dimasukkan ke dalam tanaman. Selanjutnya, A. tumefaciens secara langsung dapat memindahkan gen pada plasmid tersebut ke dalam genom (DNA) tanaman. Potongan DNA yang menginfeksi tanaman terintegrasi ke dalam kromosom tanaman melalui tumor-inducing plasmid (Ti plasmid) yang dapat mengontrol system selular tanaman dan menggunakannya untuk membuat banyak salinan DNA bakterinya sendiri. Ti plasmid adalah partikel DNA besar berbentuk lingkaran yang mereplikasi secara independen dari kromosom bakteri. Dengan cara demikian maka gen cry 1Ab akan terintegrasi dengan genom tanaman dan tetap setabil melalui pembelahan mitosis / meiosis sel tanaman. Setelah DNA asing menyatu dengan DNA tanaman maka sifat-sifat yang diinginkan dapat diekspresikan tumbuhan.

Gambar 2. tranformasi Agrobacterium tumefaciens ke dalam sel tanaman

Sel Agrobacterium tumefaciens yang sudah membawa gen cry selanjutnya ditumbuhkan bersama-sama dengan jaringan tanaman yang akan ditransformasi (teknik ko-kultivasi) jaringan tanaman yang akan di ko-kultivasi dengan Agrobacterium tumefaciens dapat diambil dari irisan daun (leaf disc). Jaringan tersebut kemudian dicelupkan sebentar ke dalam kultur Agrobacterium tumefaciens selama semalam, selanjutnya diletakkan pada kertas filter steril dan akhirnya diletakkan pada medium non-selektif untuk proses ko-kultivasi dengan Agrobacterium tumefaciens selama 2-3 hari. Medium yang digunakan tersebut juga mengandung antibiotik yang sesuai sehingga jaringan tanaman yang di transformasi tetap dapat tumbuh. Setelah proses transfer DNA selesai, dilakukan seleksi sel daun untuk mendapatkan sel yang berhasil disisipi gen cry 1Ab. Hasil seleksi ditumbuhkan menjadi kalus (sekumpulan sel yang belum terdiferensiasi) hingga nantinya terbentuk akar dan tunas. Apabila telah terbentuk tanaman muda (plantlet), maka dapat dilakukan pemindahan ke tanah untuk menumbuhkannya. Untuk menganalisis keberhasilan transformasi tanaman maka dilakukan pengujian dengan menggunakan teknik DNA blotting, PCR.

Gambar 3. skema pembuatan tanaman transgenik

Analisis dan Pengujian Keberadaan gen cry1Ab

a. Amplifikasi DNA dengan teknik PCR

Penyisipan fragmen gen cry 1Ab di dalam vektor dapat di analisis dengan melakukan amplifikasi DNA dengan teknik PCR (Polimerase Chain Reaction). Primer yang digunakan dapat berupa oligonukleotida yang komplementer fragmen gen cry 1Ab tersebut, atau oligonukleotida yang komplementer dengan bagian hulu dan hilir tempat penyisipan fragmen gen cry 1Ab tersebut. . Hasil amplifikasi selanjutnya dianalisis dengan elektroforensis menggunakan gel agarose untuk membuktikan apakah ada pita DNA yang dapat teramplifikasi. 

b. Uji imunokimia

Protein insekisida yang berasal dari B. Thuringiensis adalah protein-protein yang bukan enzim sehingga ekspresi protein-protein asing semacam ini pada tanaman transgenik tidak dapat dilakukan dengan menganalisis aktivitas enzimatiknya. Untuk itu dilakukan pengujian dengan metode imunokimia yang menggunakan antibodi terhadap protein tersebut. Antibodi yang dibuat terhadap protein semacam itu selanjutnya digunakan dalam teknik uji imunokimia, misalnya dengan tekinik ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) atau teknik imunoblotting.

Dengan teknik imunoblotting., protein-protein yang diekspresikan pada suatu jaringan tanaman, pertama kali harus di elektroforesis pada suatu gel. Kemudian dipindahkan (blotting) pada suatu membran khusus, misalnya nitroselulosa atau nilon. protein-protein yang menempel pada membran dengan (antigen) yang menjadi target analisis antibodi yang menempel pada protein target tersebut kemudian direaksikan dengan antibodi kedua yang dikonjugasi dengan enzim peroksidase. Selanjutnya ke dalam hasil reaksi antigen-antibodi tersebut ditambahkan senyawa kromogenik yang dapat menghasilkan perubahan warna. Hasil reaksi antigen-antibodi dideteksi secara langsung pada membran berupa pita berwarna.